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    在实施例1中的引物和探针的引导下进行四重实时荧光定量pcr检测，25μl实时荧光定量pcr的检测体系包括：模板5μl、实时荧光定量pcr反应液2×onestepu+μl(购于vazyme公司)、onestepu+μl(购于vazyme公司)、10μm-4×混合引物μl、10μm-4×混合探针μl，rna-freeh2o5μl。实时荧光定量pcr反应条件可为：反转录52℃15min；95℃2min；pcr扩增条件：95℃15s，56℃30s，45个循环。在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测，新洲区本地细小病菌常见问题。2)用得到的ct值或荧光信号的变化实现对cav-ii、cpv、cdv和cpiv定性检测，新洲区本地细小病菌常见问题，不同荧光通道出现标准的“s”型扩增曲线，新洲区本地细小病菌常见问题，表明待测样品中含有cav-ii、cpv、cdv和cpivbingdu，再根据荧光信号的强度和步骤，得出待测样品中所含有cav-ii、cpv、cdv和cpivbingdu的拷贝数，实现定量检测。3)具体判定方法：①若待测样品在hex通道中的扩增曲线为标准的s型曲线，且ct值≤32，则结果判定为cpivbingdu核酸阳性；②若待测样品在fam通道中的扩增曲线为标准的s型曲线，且ct值≤32，则结果判定为cpvbingdu核酸阳性；③若待测样品在cy5通道中的扩增曲线均为标准的s型曲线，且ct值≤32，则结果判定为cdvbingdu核酸阳性。武汉希望宠物医院！！新洲区本地细小病菌常见问题

    ④若待测样品在quasar705通道中的扩增曲线均为标准的s型曲线，且ct值≤32，则结果判定为cav-iibingdu核酸阳性；⑤若待测样品32＜ct值≤38，出现“s”型扩增曲线，则结果判定为可疑，即该样品需要进行复检；⑥若待测样品ct值＞38，则结果判定为阴性。检测结果如下表3所示，可见所检测的10份待测样品中均不含有四种bingdu，可以用作cav-ii、cpv、cdv和cpiv疫苗生产的原料。表310份待测样品进行cav-ii、cpv、cdv和cpivbingdu的四重实时荧光定量pcr检测结果实施例3、对cav-ii、cpv、cdv和cpivbingdu进行四重实时荧光定量pcr检测的灵敏度、特异性和重复性、特异性检测按照实施例2所述方法利用dna/rna同时进行提取的axygen试剂盒对i型和ii型犬腺bingdu(cav)、犬细小bingdu(cpv)提取dna，对犬瘟热bingdu(cdv)、犬副流感bingdu(cpiv)提取rna，同时以灭活的cav-ii、cpv、cdv和cpiv细胞培养物提取的dna或rna为阳性对照，以无酶水为阴性对照，在实施例1提供的引物和taqman探针的引导下进行实时荧光定量pcr检测，pcr反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的特异性。检测结果如图4所示，*有cav-ii、cpv、cdv和cpiv出现特定的“s”型扩增曲线且彼此能够鉴别区分，结果阳性。湖北正规的细小病菌欢迎来电武汉狗狗宠物医院！！

    预先配置含1％冰乙酸的异丙醇和在试剂bufferw1a和bufferw2中添加指定浓度的无水乙醇。(2)在μl的待测样品，并加入200μlbufferv-l，漩涡震荡混匀后，静置5min。(3)在步骤(2)的μlbufferv-n，漩涡震荡混匀，12000g离心5min。(4)将步骤(3)离心管中上清转移至2ml离心管(试剂盒内提供)中，加300μl异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均匀。(5)将制备管置于2ml离心管中(试剂盒内提供)中，取步骤(4)的混合液移入制备管中，6000g离心1min。(6)弃滤液，将制备管置回至2ml离心管中，加500μlbufferw1a，室温静置1min。12000g离心1min。(7)弃滤液，将制备管置回至2ml离心管中，加800μlbufferw2，12000g离心1min。(8)将制备管置回到2ml离心管中，12000g离心1min。(9)将制备管置于洁净的(试剂盒内提供)中，在制备管膜**加40μl无酶水，室温静置1min。12000g离心1min洗脱rna。从待测样品中提取的dna或rna作为检测样；从cav-ii、cpv、cdv和cpiv细胞培养物中提取的dna或rna作为阳性对照样；按照下述方法将从cav-ii、cpv、cdv和cpiv细胞培养物中提取的dna或rna制备获得标准品。、四重实时荧光定量pcr标准曲线的建立、pcr扩增靶标序列使用实施例1中4对特异性引物。

    本发明属于生物检测技术领域：中的兽医动物病原检测，具体涉及一种用于犬腺bingduii型、犬瘟热bingdu、犬细小bingdu和犬副流感bingdu的四重实时荧光定量pcr检测方法、检测试剂盒及其**引物和taqman探针。背景技术：：犬瘟热bingdu(caninedistempervirus，cdv)、犬细小bingdu(canineprvovirus，cpv)、犬副流感bingdu(canineparainfluenzavirus，cpiv)和犬腺bingduii型(canineadenovirusii，cav-ii)是犬bingdu性传染病暴发和流行的主要病原体。cdv染上引起的犬瘟热主要有呼吸型、消化型、神经型和混合型4种，cdv染上可引起全身性的免疫压制，病死率极高。cpv主要引起犬的急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎。cpiv染上主要引起犬的呼吸道疾病，是犬传染性呼吸系统疾病重要的病原之一。cav-ii型引起与呼吸道疾病和肠炎相关的犬接触性呼吸道疾病，但不引起肺炎症状，可引起幼犬咳嗽又叫犬窝咳。这四种bingdu单一染上或混合染上均可给养犬业带来严重的打击，四种犬病原临床症状较为相似，且常伴有混合染上，给临床诊断造成了一定的困难。文献cna建立了用于同时检测犬瘟热bingdu、犬细小bingdu、i型和ii型犬腺bingdu的多重pcr检测引物。武汉宠物诊所哪家好？

    而拷贝数低或无拷贝数的样品bingdu含量不足，不能进行成品苗的配制，且s1-s3为cav2型bingdu疫苗半成品，s4-s6为cdvbingdu疫苗半成品，s7-s8为cpvbingdu疫苗半成品，s9-s10为cpivbingdu疫苗半成品，s11-s12为四种bingdu疫苗半成品。经检测s1-s3cav2型bingdu疫苗半成品可用于配苗，s4、s6cdvbingdu疫苗半成品可用于配苗，而s5拷贝数不达标不可用于配苗，s7cpvbingdu疫苗半成品可用于配苗，而s8拷贝数不达标不可用于配苗，s9-s10cpivbingdu疫苗半成品可用于配苗，s11-s12四种bingdu疫苗半成品可用于配制四联苗。实施例6、犬只源细胞检测使用实施例4的试剂盒对金宇保灵生物药品有限公司疫苗研究室提供的5份犬只源细胞的bingdu染上情况进行检测，检测方法与实施例2中步骤，待测样品编号为t1-t5，检测结果如下表6所示，可见本发明提供的对cav-ii、cpv、cdv和cpiv进行四重实时荧光定量pcr检测的试剂盒能够实现对犬只源细胞中bingdu染上的定性检测及bingdu含量的定量检测，可为疫苗生产过程中源材料的质量监控提供有力依据，确保疫苗生产的安全。表6：5份犬只源细胞样品的四重实时荧光定量pcr检测结果根据上表6的定性和定量检测结果。武汉动物医院哪家好？武昌区正规的细小病菌多少钱

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