cdv-r)的核苷酸序列如sedid**2所示;用于检测犬瘟热bingdu的taqman探针(cdv-p),所述taqman探针(cdv-p)的核苷酸序列如sedid**8所示;用于检测犬细小bingdu的上游引物(cpv-f)和下游引物(cpv-r),其中所述上游引物(cpv-f)的核苷酸序列如sedid**3所示,所述下游引物(cpv-r)的核苷酸序列如sedid**4所示;用于检测犬细小bingdu的taqman探针(cpv-p),所述taqman探针(cpv-p)的核苷酸序列如sedid**9所示;用于检测犬副流感bingdu的上游引物(cpiv-f)和下游引物(cpiv-r),其中所述上游引物(cpiv-f)的核苷酸序列如sedid**5所示,所述下游引物(cpiv-r)的核苷酸序列如sedid**6所示;用于检测犬副流感bingdu的taqman探针(cpiv-p),所述taqman探针(cpiv-p)的核苷酸序列如sedidno:20所示;所述taqman探针为经过荧光标记的,其5’端标记有荧光报告基团,3’端标记有荧光淬灭基团,且所述taqman探针的3’端已经磷酸化处理,硚口区中**细小病菌欢迎来电,硚口区中**细小病菌欢迎来电。上述taqman探针(cav2-p)的5’端标记有quasar705荧光报告基团,硚口区中**细小病菌欢迎来电,3’端标记有bhq3荧光淬灭基团;上述taqman探针(cdv-p)的5’端标记有cy5荧光报告基团,3’端标记有bhq2荧光淬灭基团;上述taqman探针(cpv-p)的5’端标记有fam荧光报告基团。武汉狗狗宠物医院!!硚口区中**细小病菌欢迎来电
本发明属于分子生物学技术领域,涉及鸡细小bingdu与h9亚型禽流感bingdu二重pcr检测引物组、试剂盒及方法。鸡细小bingdu(chinckenparvovirus,chpv)是引发鸡群发生肠道疾病的重要bingdu之一,临床上以腹泻、呈现精神抑郁和生长迟缓及料肉比增加等为特征。chpv主要侵害雏鸡,主要造成患病鸡腹泻和发育不良,该bingdu在某些鸡群中普遍存在,研究发现在发育障碍与矮小综合征鸡群的血清中能检测出chpvdna。流行病学调查表明其在商品肉鸡染上率较高、蛋鸡或种鸡次之。近年来研究表明chpv在全球多个国家的鸡群中普遍存在,且近年来相继在北美的美国和巴西、东欧的波兰和匈牙利、克罗地亚及亚洲的韩国和中国等地区发现报道。禽流感bingdu(avianinfluenzavirus,aiv)是正黏bingdu科中a型流感bingdu属成员。根据其表面抗原血凝素蛋白(hemagglutinin,ha)和神经氨酸酶蛋白(neuraminidase,na)的差异可以将aiv划分为16种不同的ha亚型(h1~h16)和9种不同的na亚型(n1~n9)。依据aiv对鸡致病性的强弱,aiv还可以分为高致病性aiv(hpaiv)和低致病性aiv(lpaiv)。h9亚型禽流感bingdu自1966年在美国初次被发现,随后我国广东地区也于1994年初次在发病鸡体内发现了该亚型aiv。汉阳区一般的细小病菌多少钱宠物医院拍片子多少钱?
预先配置含1%冰乙酸的异丙醇和在试剂bufferw1a和bufferw2中添加指定浓度的无水乙醇。(2)在μl的待测样品,并加入200μlbufferv-l,漩涡震荡混匀后,静置5min。(3)在步骤(2)的μlbufferv-n,漩涡震荡混匀,12000g离心5min。(4)将步骤(3)离心管中上清转移至2ml离心管(试剂盒内提供)中,加300μl异丙醇(1%冰乙酸),上下倒置6-8次,混合均匀。(5)将制备管置于2ml离心管中(试剂盒内提供)中,取步骤(4)的混合液移入制备管中,6000g离心1min。(6)弃滤液,将制备管置回至2ml离心管中,加500μlbufferw1a,室温静置1min。12000g离心1min。(7)弃滤液,将制备管置回至2ml离心管中,加800μlbufferw2,12000g离心1min。(8)将制备管置回到2ml离心管中,12000g离心1min。(9)将制备管置于洁净的(试剂盒内提供)中,在制备管膜**加40μl无酶水,室温静置1min。12000g离心1min洗脱rna。从待测样品中提取的dna或rna作为检测样;从cav-ii、cpv、cdv和cpiv细胞培养物中提取的dna或rna作为阳性对照样;按照下述方法将从cav-ii、cpv、cdv和cpiv细胞培养物中提取的dna或rna制备获得标准品。、四重实时荧光定量pcr标准曲线的建立、pcr扩增靶标序列使用实施例1中4对特异性引物。
cdv的检测序列为cdvh基因5’端第1106-1253位碱基,序列表中sedidno:6所示;cpv的检测序列为cpvvp2基因5’端第642-828位碱基,序列表中sedidno:7所示;cpiv的检测序列为cpivnp基因5’端第49-216位碱基,序列表中sedidno:8所示。用,分别获得多组对cav-ii、cpv、cdv和cpiv进行实时荧光定量pcr检测的引物及taqman探针,以同时能对cav-ii、cpv、cdv和cpiv进行检测为目标,经过差异位点的分析比对,并通过交叉实验验证从中推荐能同时对cav-ii、cpv、cdv和cpiv进行实时荧光定量pcr检测的引物及taqman探针,确定序列如下:cav2-f(上游引物):5’-gatgtaaatgaccagtcctttgc-3’(序列表中sedidno:9)cav2-r(下游引物):5’-agtaggggtcgtaaggtgagc-3’(序列表中sedid**0);cdv-f(上游引物):5’-agaaacaagaggagcaaaaaaactg-3’(序列表中sedid**1)cdv-r(下游引物):5’-tcaatgcttggatctagaggtaatg-3’(序列表中sedid**2);cpv-f(上游引物):5’-tgaacttgctacagggacatttt-3’(序列表中sedid**3)cpv-r(下游引物):5’-atttcccatttgagttacaccac-3’(序列表中sedid**4);cpiv-f(上游引物):5’-catatgagcgattcacactcactc-3’(序列表中sedid**5)cpiv-r。 光谷宠物医院哪家好?
④若待测样品在quasar705通道中的扩增曲线均为标准的s型曲线,且ct值≤32,则结果判定为cav-iibingdu核酸阳性;⑤若待测样品32<ct值≤38,出现“s”型扩增曲线,则结果判定为可疑,即该样品需要进行复检;⑥若待测样品ct值>38,则结果判定为阴性。检测结果如下表3所示,可见所检测的10份待测样品中均不含有四种bingdu,可以用作cav-ii、cpv、cdv和cpiv疫苗生产的原料。表310份待测样品进行cav-ii、cpv、cdv和cpivbingdu的四重实时荧光定量pcr检测结果实施例3、对cav-ii、cpv、cdv和cpivbingdu进行四重实时荧光定量pcr检测的灵敏度、特异性和重复性、特异性检测按照实施例2所述方法利用dna/rna同时进行提取的axygen试剂盒对i型和ii型犬腺bingdu(cav)、犬细小bingdu(cpv)提取dna,对犬瘟热bingdu(cdv)、犬副流感bingdu(cpiv)提取rna,同时以灭活的cav-ii、cpv、cdv和cpiv细胞培养物提取的dna或rna为阳性对照,以无酶水为阴性对照,在实施例1提供的引物和taqman探针的引导下进行实时荧光定量pcr检测,pcr反应体系及反应条件参照实施例2,以验证该方法的特异性。检测结果如图4所示,*有cav-ii、cpv、cdv和cpiv出现特定的“s”型扩增曲线且彼此能够鉴别区分,结果阳性。武汉哪有好的宠物医生?汉阳区一般的细小病菌多少钱
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另一种为肠炎型,肠炎型出现症状后为发病的第二天,主要为呕吐白色泡沫或者未消化食物,腹泻,粪便为黄色半成型,带有腥味,部分肠炎型狗患者腹泻后为白色的稀便,少数极差的狗患者初期就会出现便便为透明状液体,带有血丝。根据本人经验应该是肠粘膜脱落。随着病情发展呕吐愈发严重,呕吐白色泡沫,便便为咖啡色或者绿色果冻状便便,腥臭。然后发展为明显的特征:喷状粪便,腥臭极其重,颜色为咖啡色或者绿色或者番茄色,为肠粘膜脱落,肠道出血引起。肠炎型细小重要的是对症下药,肠炎型细小会引起酸中毒,肠道大出血,肠道吸收,所以必须尽快酸中毒,止血。酸中毒主要是医用碳酸氢钠,止血为止血敏针剂或者其他止血。如果对症下药,缓解症状,病好的几率还是很大的,而且会终身免疫犬细小。酸中毒(解决为奥美拉错注射液,辅助为6542注射液)引起原因请看下面。
酸中毒引起原因:酸中毒要是因为狗狗本身长期未进食,胃酸空分泌,腐蚀到了胃壁,胃壁失去了粘膜的保护,结果导致酸性物质被吸收,引发酸中毒,这只是其中一种原因,还有一部分原因。但是这是主要的。 硚口区中**细小病菌欢迎来电
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